Tematyka badań prowadzonych w ZBF

Ludzkie czynniki transkrypcyjne

Andrzej Górecki, Piotr Bonarek

Zasadniczym obiektem prowadzonych prac badawczych są ludzkie czynniki transkrypcyjne: YY1, TF2B, TBP YAF2, ATF7. Celem badań jest określenie mechanizmów rozpoznawania specyficznych sekwencji DNA, poznanie struktury wieloskładnikowego kompleksu transkrypcyjnego, określenie kinetyki oraz zmian konformacyjnych towarzyszących tworzeniu kompleksów. Prace prowadzone są w warunkach in vitro w oparciu o rekombinowane białka uzyskiwane w bakteryjnym systemie ekspresyjnym, oczyszczane z wykorzystaniem technik chromatografii cieczowej.

Jesteśmy zainteresowani poznaniem mechanizmów działania białek samoistnie nieustrukturyzowanych (IUPs, ang: Intrinsically Unstructured Proteins), w szczególności wpływu czynników zewnętrznych na zmianę ich konformacji przestrzennej.

W badaniach wykorzystywane są stacjonarne i rozdzielcze w czasie techniki spektroskopii fluorescenyjnej bazujące zarówno na fluoroforach naturalnie występujących w biocząsteczkach jak i sondach fluorescencyjnych. Wykorzystujemy także spektroskopię dichroizmu kołowego (CD), mikrokalorymetrię (ITC, DSC), dynamiczne rozproszenie światła laserowego (DLS), technikę sączenia molekularnego (SEC) oraz rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR).

Nanocząstki i oligomeryzacja receptorów zależnych od białek G (GPCRs)

Marta Dziedzicka-Wasylewska, Sylwia Łukasiewicz

Fizyczna asocjacja białek receptorowych stanowi mechanizm, poprzez który różnorodne ścieżki sygnałowe mogą podlegać konwergencji; znajomość mechanizmów regulujących te procesy może mieć duże znaczenie w opracowaniu nowych czynników terapeutycznych Obecnie ponad 50% leków dostępnych na rynku działa, poprzez wpływ na przekaz sygnału związany z GPCRs (ang. G-protein coupled receptors). Receptory sprzężone z białkami G – a w tym receptory dla neuroprzekaźników takich jak dopamina i serotonina mogą asocjować i tworzyć formy homo- bądź hetero-oligomeryczne. Zjawisko to odgrywa istotną rolę w farmakologii, jako że hetero-dimery mogą funkcjonować w nieco inny sposób niż w sytuacji, gdy występują oddzielnie i działają niezależnie od siebie.

Postuluje się znaczenie hetero-dimeryzacji receptorów dopaminowych D2 i serotoninowych 5-HT2A w etiologii schizofrenii. Receptory te stanowią bowiem punkty działania leków antypsychotycznych nowej generacji takich jak klozapina, a zatem selektywna regulacja hetero-dimeryzacji w/w receptorów może mieć znaczenie w terapii. Wiadomo, że nie we wszystkich regionach mózgu mogą występować dimery D2-5-HT2A, bo nie w każdej populacji neuronów badane receptory występują na tej samej komórce, a tylko wtedy mogą one tworzyć takie kompleksy. Biorąc pod uwagę powyższe oraz fakt, iż dotychczas dostępne leki adresowane tylko dla niewielkiej części populacji komórek w układzie nerwowym, są dostarczane niespecyficznie we wszystkie obszary mózgu, opracowanie drogi selektywnej regulacji hetero-kompleksów jest niezwykle istotne.

Procesy kontrolowanego uwalniania substancji aktywnych inkorporowanych w nano i mikrokapsułkach są coraz szerzej stosowane w technologiach biomedycznych. Podawanie leku w formie kapsułkowanej zwiększa jego skuteczność przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości użytej substancji czynnej a jej selektywne uwalnianie tylko w określonym miejscu przeznaczenia pozwala zmniejszyć niepożądane efekty uboczne. Dlatego celem obecnych badań jest uzyskanie nanokapsułek zawierających klozapinę, dla których punktem działania będą hetero-dimery receptorów D2-5-HT2A. Uzyskane w ten sposób działanie specyficzne tkankowo może mieć kluczowe znaczenie w nowoczesnej terapii schizofrenii.

Ponadto prowadzone są badania skupiające się na oszacowaniu fizycznej interakcji innych GPCRs, określeniu wpływu wybranych terapeutyków na ten proces oraz określeniu poziomu wtórnego przekaźnika informacji wewnątrzkomórkowej uruchamianego w wyniku aktywacji receptorów.

Molekularny opis chorób neuropsychiatrycznych oraz charakterystyka działania neuroleptyków i leków przeciwdepresyjnych poprzez kompleksową analizę proteomiczną

Sylwia Kędracka-Krok, Ewelina Fic

Schorzenia neuropsychiatryczne, takie jak depresja i schizofrenia, cechują się bardzo złożoną etiologią. Obecnie wiadomo, że wpływ na ich rozwój mają czynniki genetyczne oraz środowiskowe, jak również wielorakie zaburzenia biochemiczne. Mimo wieloletnich badań nad molekularnym podłożem tych chorób przyczyny wciąż pozostają niejasne. Niewątpliwie te dotykające znaczny procent populacji choroby (10% depresja, 1% schizofrenia) nie są wynikiem zaburzeń w poziomie pojedynczego białka, lecz są konsekwencją upośledzenia funkcjonowania lub/i wzajemnych interakcji złożonego zbioru białek. Podobnie mechanizm działania leków przeciwdepresyjnych i przeciwpsychotycznych jest słabo poznany i wymaga dalszych kompleksowych badań.

Podejście proteomiczne ze względu na  swój holistyczny charakter oraz fakt, że w centrum zainteresowania pozostają białka, czyli rzeczywiste czynniki efektorowe komórki, umożliwia wykrycie istotnych, a dotychczas nieznanych lub pomijanych mechanizmów biochemicznych, które stanowią pierwotne źródło choroby.

W prowadzonych badaniach wykorzystywane są zwierzęce modele chorób oraz linie komórkowe. W pracy posługujemy się całym spektrum zaawansowanych metod proteomicznych takich jak dwuwymiarowa elektroforeza z barwieniem fluorescencyjnym i różnicowym (DIGE), spektrometria masowa (MS) w aspekcie identyfikacji białek oraz w celu bezżelowych analiz ilościowych (typu shot gun) tak znacznikowych (z zastosowaniem znaczników iTRAQ) jak i bezznacznikowych. Ponadto stosujemy wiele metod subfrakacjonowania białek z wykorzystaniem metod biochemicznych i biofizycznych takich jak chromatografia, wirowanie różnicowe, izoogniskowanie. Analiza wybranych subproteomów umożliwia bardziej szczegółowy opis biochemiczny badanych procesów uwzględniający niskokopijne białka takie jak: czynniki transkrypcyjne, receptory błonowe czy białka określonych komapartmentów komórkowych. Prowadzimy na przykład badania subproteomów białek jądrowych i błonowych oraz fosforylowanych w zwierzęcym modelu padaczki skroniowej wywołanej podaniem pilokarpiny.
Wykorzystujemy także metody biologii molekularnej do konstruowania etykietek pozwalających na identyfikacje natywnych kompleksów białkowych dla wybranych interesujących białek. W najbliższym czasie rozpoczniemy badania proteomiczne krwi pacjentów cierpiących na depresję, mające na celu odnalezienie markerów choroby i działania leków przeciwdepresyjnych.