Wspomnienie o profesorze Zygmuncie Wasylewskim (1942–2006)

Zygmunt Wasylewski urodził się 13 czerwca 1942 roku w Chrzanowie. Tam też ukończył szkołę podstawową i w 1956 roku podjął naukę w Technikum Mechanicznym, którą po roku kontynuował w Technikum Koksochemicznym w Chorzowie gdzie uzyskał świadectwo dojrzałości. W latach 1962-1968 studiował chemię na Wydziale Matematyczno-Fizyczno-Chemicznym Uniwersytetu Jagiellońskiego. Pracę magisterską wykonał pod kierunkiem profesora Ostrowskiego w Międzywydziałowej Katedrze Chemii Fizjologicznej krakowskiej Akademii Medycznej. W pracy tej zatytułowanej „Wyznaczanie parametrów cząsteczkowych fosfomonoesterazy metodą sączenia molekularnego" Zygmunt Wasylewski przedstawił wyznaczone eksperymentalnie wartości efektywnego promienia Stokesa, współczynnika dyfuzji oraz masy cząsteczkowej fosfomonoestrazy. Następnie przez rok mgr Wasylewski pracował na stanowisku asystenta naukowo-technicznego w Zakładzie Koloidów Katedry Chemii Fizycznej Wydziału Mat-Fiz-Chem. UJ.

W 1969 roku rozpoczął pracę w kierowanym przez profesora Reifera Zakładzie Fizjologii i Biochemii Roślin rodzącego się właśnie (1970 rok) Instytutu Biologii Molekularnej UJ. Tematyka badawcza tego Zakładu nie pokrywała się jednak z zainteresowaniami młodego magistra, który w 1971 roku przeniósł się do kierowanego przez prof. Marię Sarnecką-Keller Zakładu Biochemii Zwierząt tegoż Instytutu. Już w dwa lata później mgr Wasylewski obronił doktorat pt. „Własności molekularne różnorodnych form kwaśnych fosfataz z wątroby i leukocytów", którego promotorem był prof. Koj. W pracy tej posługując się z wyczuciem technikami chromatograficznymi, elektroforetycznymi oraz stosując ultrawirowanie w gradiencie gęstości mgr Wasylewski określił stopień oligomeryzacji cząsteczek badanych fosfataz oraz geometrię ułożenia białkowych podjednostek, a także wykazał podobieństwo strukturalne kwaśnych fosfataz wyizolowanych z różnych tkanek.

W dalszej pracy zainteresowania naukowe doktora Zygmunta Wasylewskiego koncentrowały się wokół oddziaływań białek modelowych z niejonowymi i jonowymi detergentami, w tym w szczególności z detergentami kationowymi. W badaniach tych posługiwał się szeregiem zaawansowanych metod fizykochemicznych takich jak techniki spektroskopii w podczerwieni, Ramana, EPR, techniki hydrodynamicze jak filtracja żelowa, ultrawirowanie czy dializa równowagowa. Samodzielność i zaangażowanie zaowocowały obfitością publikacji i tytułem doktora habilitowanego uzyskanym w ciągu zaledwie sześciu lat (1979 rok).

Nowy rozdział w życiu naukowym doktora Wasylewskiego otworzył wyjazd na roczne (1979/80) stypendium do San Antonio (Texas University) gdzie zainteresował się zastosowaniem metody spektroskopii fluorescencji w badaniach struktury, własności i dynamiki białek. Trzeba podkreślić, że metody te pozwalają w łatwy sposób badać białka w roztworach wodnych, stanowiąc tym samym (obok NMR) niezbędne uzupełnienie dla metod krystalograficznych.

Docenta Wasylewskiego (tytuł docenta uzyskał w 1981 roku) można zaliczyć w poczet pionierów wdrażania technik fluorymetrycznych do biochemii białek. Obiektem „fluorescencyjnych" dociekań doc. Wasylewskiego były w tym okresie enzymy takie jak rodanaza, sulfotransferaza tiosiarczanu, heksokinaza drożdżowa, dehydrogenaza alkoholowa, metaloproteinaza, kinaza fosfoglicerynianu a także ludzki inhibitor proteinaz serynowych i wiele innych białek zawierających dwie lub więcej reszt tryptofanowych. Rezultatem tych prac były powstałe m.in. w kooperacji z prof. Horowitzem artykuły dotyczące indukowanych temperaturą i wiązaniem liganda zmian konformacyjnych białek w roztworze. Dalszemu rozwojowi w tej dziedzinie sprzyjała też współpraca doc. Wasylewskiego z prof. Efftinkiem z University of Mississippi (1986/87 roczny i w 1991 roku 3 miesięczny pobyt w charakterze visiting professor).

W 1986 roku doc. Wasylewski wraz z kierowanym przez siebie zespołem badawczym opracował technikę rozkładu złożonych widm emisji fluorescencji białek wielo-tryptofanowych za pomocą wygaszania fluorescencji (FQRS – ang. fluorescence-quenching-resolved-spectroscopy). Technika ta jest dziś szeroko stosowana i znalazła swoje miejsce w renomowanych podręcznikach z zakresu spektroskopii fluorescencji.

W 1989 roku doc. Wasylewski uzyskał tytuł profesora biochemii, a w 1991 roku istniejąca już od początku lat 80-tych kierowana przez Niego grupa badawcza (Pracownia Fizykochemii Biopolimerów działająca w obrębie Zakładu Biochemii Zwierząt) została przekształcona w Zakład Biochemii Fizycznej. Zaplecze aparaturowe, wtedy jeszcze pracowni prof. Wasylewskiego, było stosunkowo bogate, a to dzięki niespotykanym zdolnościom konstruktorskim, uporowi i entuzjazmowi profesora Wasylewskiego, który projektował urządzenia, szukał wykonawców dla podzespołów projektowanej aparatury daleko poza murami Uniwersytetu, a następnie często własnoręcznie skręcał i montował poszczególne elementy. Trzeba tu przypomnieć, że możliwości pozyskiwania funduszy na zakup specjalistycznego sprzętu przez środowiska naukowe były wówczas niemal żadne, ale w momencie, kiedy sytuacja nieco się poprawiła, czyli mniej więcej w połowie lat 90-tych, Profesor niezwłocznie rozpoczął starania o zakup wysokiej klasy aparatury pomiarowej.

Początkowo zainteresowania badawcze prof. Wasylewskiego ogniskowały się na wykorzystaniu metody FQRS i innych technik fluorescencyjnych do badania dynamiki molekularnej białek (m.in. parwalbuminy, melityny) w roztworze, ale też w modelowych układach błon biologicznych i w micelach. Zajmował się On wówczas badaniem mechanizmów wygaszania fluorescencji, efektu red edge oraz jakościową i ilościową analizą widm emisji fluorescencji. Jednak nieco później wykrystalizował się główny obszar tematyczny Zakładu Biochemii Fizycznej, który dotyczył wpływu wiązania funkcjonalnych ligandów przez bakteryjne białka regulatorowe na strukturę, dynamikę i funkcję tychże białek. Obiektami badawczymi prof. Wasylewskiego były białka regulujące procesy transkrypcji E. coli tzn.: represor operonu tryptofanu (TrpR), represor tetracykliny (TetR) oraz białko wiążące cAMP (CRP). Koordynowane przez prof. Wasylewskiego badania nad represorem tryptofanu z wykorzystaniem zmodyfikowanego białka pozbawionego zupełnie reszt tryptofanowych pozwoliły na określenie charakteru mikrootoczenia L-tryptofanu lokującego się w białku, a także wykazały znaczące zmiany w obszarze kieszeni wiążącej L-tryptofan pod wpływem wiązania się kompleksu TrpR-L-tryptofan do DNA. W badaniach tych wykorzystano technikę FQRS, a także stacjonarne i rozdzielcze w czasie pomiary emisji fluorescencji tryptofanu, jak również pomiary dichroizmu kołowego. Prowadzone równolegle badania represora tetracykliny z wykorzystaniem tych samych metod pomiarowych i mutantów białkowych zawierających pojedyncze reszty tryptofanu umożliwiły poznanie dynamiki konformacyjnej domeny białka odpowiedzialnej za oddziaływanie z DNA oraz charakterystykę zmian strukturalnych domen TetR zachodzących w wyniku interakcji białka z tetracykliną lub operatorowymi fragmentami DNA. Z kolei zastosowanie metody zatrzymanego przepływu (ang. stopped-flow) z detekcją fluorescencyjną pozwoliło na scharakteryzowanie kinetycznego mechanizmu oddziaływania białka TetR z DNA, a także na kinetyczny opis procesu indukcji ekspresji genów kodujących białka oporności pod wpływem wiązania tetracykliny, jak również na określenie roli jonów magnezu w procesie indukcji. Zastosowanie metody izotermicznego miareczkowania kalorymetrycznego (ITC) umożliwiło poznanie termodynamiki oddziaływania TetR - tetracyklina, natomiast na podstawie danych uzyskanych techniką różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) zaproponowano model procesu termicznej denaturacji TetR i scharakteryzowano wpływ tetracykliny na stabilność białka.

Najobszerniejszą i prawdopodobnie najcenniejszą część dorobku naukowego prof. Wasylewskiego stanowią prace dotyczące białka CRP. Przygoda z CRP rozpoczęła się, można by rzec niewinnie, od charakterystyki własności fluorescencyjnych białka. Ale już nieco późniejsze, niełatwe kinetyczne badania z wykorzystaniem techniki zatrzymanego przepływu pozwoliły poznać stabilność oraz kinetykę zwijania i rozwijania białka, zaś dzięki zastosowaniu selektywnego fluorescencyjnego znakowania reszt cysteiny możliwe stało się zaproponowanie szczegółowego mechanizmu denaturacji chemicznej białka CRP. Urzeczywistnienie pomysłów Profesora dotyczących dalszych badań nad funkcją i strukturą białka CRP wymagało wprowadzenia wielu mutacji punktowych w „newralgicznych" obszarach białka. Realizacja tego ostatniego celu była tyleż wyzwaniem ileż pociągającą perspektywą. Dzięki niezłomności Profesora w dążeniu do wytyczonego celu, w obrębie Zakładu Biochemii Fizycznej powstała jedna pierwszych w Instytucie Biologii Molekularnej pracownia biologii molekularnej, w której metodą overlap extension PCR wprowadzano mutacje, weryfikując je następnie poprzez sekwencjonowanie DNA. Intensywność badań prowadzonych nad wieloma mutantami białka CRP wymogła konieczność modyfikacji technik hodowli bakteryjnych i oczyszczania białek. Efektem tego było wprowadzenie do procedur laboratoryjnych zaawansowanych metod chromatografii powinowactwa oraz automatyzacja preparatyki białka, możliwa dzięki wykorzystaniu biofermentora i specjalistycznego układu chromatograficznego. Zastosowanie mutantów pozwoliło na monitorowanie wywołanych oddziaływaniem z ligandem, zmian allosterycznych w CRP, dzięki czemu opisany został szczegółowy kinetyczny mechanizm wiązania cAMP. Jednocześnie prowadzone były wszechstronne badania strukturalne (z użyciem DLS, FRET, wygaszania fluorescencji, stacjonarnych i rozdzielczych w czasie pomiarów emisji i anizotropii fluorescencji) mające na celu opisanie zmian konformacyjnych w białku wywołanych jego oddziaływaniem z cAMP i DNA. Z kolei badania termodynamiki tworzenia kompleksu CRP-cAMP przeprowadzone zostały z wykorzystaniem metod mikrokalorymetrycznych (ITC, DSC). Ponieważ struktura krystalograficzna białka CRP nieskompleksowanego z ligandem nie jest do tej pory znana w środowisku naukowym toczyła się dyskusja na temat symetrii strukturalnej podjednostek homodimeru. W kontekście powstałego problemu badawczego zrodził się nowy nietuzinkowy pomysł prof. Wasylewskiego dotyczący konstrukcji heterodimeru białka CRP posiadającego tylko jedną resztę tryptofanu. Wyniki badań kinetyki wiązania cAMP monitorowanej przez transfer energii pomiędzy resztą Trp a znacznikiem fluorescencyjnym przyłączonym do reszty cysteiny, znajdującej się w tej samej co Trp lub drugiej podjednostce białka, wykazały symetrię konformacyjną podjednostek białka CRP.

Uwieńczenie pracy z CRP stanowił projekt mający na celu zbadanie wzajemnych oddziaływań pomiędzy elementami całego kompleksu transkrypcyjnego E. coli z wykorzystaniem wybranych fragmentów promotorowych DNA. Realizacja tego trudnego projektu wymagała rekonstrukcji polimerazy RNA z oczyszczonych rekombinatowych podjednostek białkowych. Tworzenie kompleksu transkrypcyjnego, w skład którego obok polimerazy RNA wchodził kompleks CRP-cAMP, monitorowano przez pomiary anizotropii fluorescencji znakowanych fluorescencyjnie odcinków DNA. W efekcie określono wpływ CRP na specyficzne i niespecyficzne interakcje RNAP-DNA. Ponadto zastosowanie spektroskopii fluorescencyjnej rozdzielczej w czasie (FRET, anizotropia fluorescencji) umożliwiło badanie dynamiki konformacyjnej kompleksów transkrypcyjnych.

Profesora Wasylewskiego fascynowały odkrycia techniczne w dziedzinie biochemii fizycznej i inżynierii molekularnej, którymi przecież koniec wieku XX eksplodował. Nie tylko podążał za nimi, aktualizując swoją wiedzę, ale wykorzystywał je praktycznie jako użyteczne narzędzia w codziennej pracy. Talent konstruktorski Profesora, ale i pragmatyczny rys Jego osobowości ujawniły się po raz kolejny w momencie, gdy wkraczając na zupełnie nowe obszary tematyki naukowej rozpoczął On badania nad wzajemnymi relacjami ludzkich receptorów neuroprzekaźników w błonach plazmatycznych. Przypuszczenia na temat ich heterodimeryzacji udało się po raz pierwszy potwierdzić eksperymentalnie właśnie dzięki Niemu, a należy podkreślić, że konkurencja w tej dziedzinie nauki jest ogromna. Planowane eksperymenty miały polegać na pomiarze czasów życia fluorescencji białek fluorescencyjnych związanych z receptorami w pojedynczej żywej komórce i wymagały zastosowania skomplikowanej aparatury, na zakup której nie było jednak środków. Potrzeba odpowiedzi na postawione pytanie była dla Profesora tak paląca, że korzystając z dostępnych w laboratorium podzespołów stworzył funkcjonalny układ pomiarowy.

Ostatni rok życia prof. Wasylewskiego wypełniły głównie prace nad konkretyzowaniem dwóch zupełnie nowych projektów naukowych. Jeden z nich dotyczył ludzkiego białka regulatorowego Ying-Yang1 i stanowił pewną analogię i rozszerzenie badań prowadzonych na bakteryjnym białku CRP drugi zaś miał polegać na zastosowaniu metod genomiki i proteomiki do badania wpływu leków przeciwdepresyjnych na profil białkowy komórki nerwowej. Etap ten zakończył się pełnym sukcesem manifestującym się pozyskaniem środków finansowych potrzebnych na realizację zamierzonych zadań.

Prof. Wasylewski był kierownikiem czterech 3-letnich projektów badawczych i jest autorem lub współautorem ok. 60-ciu publikacji naukowych. W 1991 roku został odznaczony Krzyżem Kawalerskim Orderu Odrodzenia Polski, a w 2002 roku uzyskał tytuł profesora zwyczajnego. Był też członkiem Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, a od początku lat 90-tych wielokrotnie był członkiem sekcji biologii molekularnej, biochemii i biofizyki Komitetu Badań Naukowych.

Drugim bardzo ważnym aspektem aktywności zawodowej profesora Wasylewskiego była praca dydaktyczna. Jako asystent prowadził zajęcia laboratoryjne w ramach pracowni specjalistycznej z biochemii. później, już jako adiunkt (1973 rok) - również z analizy instrumentalnej w biochemii. W 1980 roku doc. Wasylewski rozpoczął wykłady z biochemii fizycznej, które ściśle korelowały z prowadzonymi przez pracowników Jego Pracowni zajęciami laboratoryjnymi. Po ukształtowaniu się pracowni biologii molekularnej, w 1998 roku, wprowadził kurs inżynierii białka, który obejmował zarówno ćwiczenia jak i wykłady. Szczególnie ten ostatni kurs cieszy się dużym zainteresowaniem studentów, gdyż w całościowy sposób ujmuje zagadnienie otrzymywania mutantów białkowych, począwszy od manipulacji na poziomie DNA, przez izolację białka aż po określenie jego podstawowych własności strukturalnych i sprawdzenie aktywności biologicznej. Wraz z wprowadzeniem specjalizacji biochemii na kierunku Biotechnologii powstały dwa wysoce zaawansowane kursy: biochemia fizyczna II i inżynieria białka II. Prof. Wasylewski był promotorem 13 prac doktorskich i kilkudziesięciu prac magisterskich, był też recenzentem wielu prac naukowych i projektów badawczych.

Prof. Wasylewski był zawsze życzliwy studentom, zawsze miał dla nich czas i co rzadkie, pojawiających w zakładzie młodych ludzi obdarzał wielkim kredytem zaufania. Potrafił przyciągać studentów na wiele sposobów; w jednych rozbudzał żywe zainteresowanie tematyką lub metodyką, innych zarażał naukowym entuzjazmem, a jeszcze innych ujmował swoją otwartością i urokiem osobistym. Pewna studentka zapytana przez Profesora, czym chciałaby się zajmować w swojej pracy magisterskiej odpowiedziała – „Ja to bym chciała sklonować Mozarta", na co Profesor odpowiedział – „A my to właśnie robimy". Ta anegdota pokazuje jedną ważną cechę profesora Wasylewskiego: był On wizjonerem, wytyczał sobie cele, które dla innych mogły pozostawać jedynie w sferze marzeń i bez kompleksów dążył do ich realizacji. Lubił otaczać się młodymi ludźmi, którzy byli w stanie podzielać Jego entuzjazm i optymizm. Analizując Jego rozwój naukowy widać wyraźnie ewolucję tematyki, która stawała się coraz bardziej złożona, ale też coraz bardziej ważka, bardziej interesująca i jednocześnie coraz trudniejsza.

Życie zawodowe profesora Wasylewskiego nierozłącznie splecione było z życiem Instytutu Biologii Molekularnej (Wydział BiNoZ UJ). W latach 1981-1984 pełnił funkcję Zastępcy Dyrektora Instytutu ds. dydaktyki, a w latach 1997-2003 funkcję kierownika studiów doktoranckich. Był współtwórcą kierunku Biotechnologia i brał udział w procesie wyodrębnienia się Wydziału Biotechnologii UJ (2002 rok). Kilkakrotnie podejmował wysiłki zmierzające do utworzenia kierunku studiów Biochemii, będąc głęboko przekonanym o potrzebie wzmacniania kondycji swojej ukochanej dyscypliny nauki. Starania te niestety zakończyły się niepowodzeniem i pozostały niespełnionym marzeniem Profesora.

Prof. Wasylewski był człowiekiem, któremu leżało na sercu dobro kraju, o czym świadczyć może Jego zaangażowanie w działalność opozycyjną w okresie stanu wojennego i później. Był On jednym z sześciu członków uniwersyteckiej Tajnej Komisji Zakładowej Solidarności. Komisja ta, złożona z rekomendowanych członków oficjalnej struktury Solidarności była wyrazem sprzeciwu ludzi nauki wobec sponiewierania, którego doświadczali od „ludzi systemu". Działała ona w latach 1982-1988, a jej głównymi zadaniami było: przełamanie monopolu informacji „systemu" poprzez kolportaż prasy podziemnej, pomoc represjonowanym naukowcom, a także kontrola wewnętrzna władz uczelni poprzez opiniowanie kandydatów na ważne stanowiska. Działalność Komisji wiązała się z poważnym ryzykiem, czego jej członkowie byli świadomi, ale poczucie obowiązku wobec Uczelni i wobec kraju, a przede wszystkim poczucie godności kazały im to ryzyko podejmować. Co ciekawe, przez pewien czas spotkania Komisji odbywały się w mieszkaniu prof. Wasylewskiego. Później powstała Tajna Komisja Międzyuczelniana, w której prof. Wasylewski był reprezentantem UJ. Te ważne fakty z życia Uniwersytetu wciąż czekają na opisanie, podobnie jak inne, nie zawsze chlubne, szczegóły z tamtego trudnego okresu, ale co brzmi obiecująco stały się one w ostatnim czasie obiektem badań specjalnej Komisji Senackiej UJ.

Prof. Wasylewski był człowiekiem niezwykle energicznym, wiecznie młodym duchem, ale również bardzo sprawnym fizycznie. Jego pasją było narciarstwo i był rzeczywiście świetnym narciarzem, o czym mogli się przekonać naocznie uczestnicy dorocznej instytutowej szkoły zimowej. Był wyjątkowym człowiekiem łączącym w sobie wydawałoby się sprzeczne cechy pragmatyka i idealisty. Zapatrzony w przyszłość, pogodny, rodzinny, po prostu ludzki, odszedł nagle, w kwiecie wieku, pogrążając w żalu współpracowników i przyjaciół.


zebrała: dr Sylwia Kędracka-Krok